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人類首次人工合成活新冠病毒:用已知基因序列構建



近日,瑞士一個科研團隊在已知新冠病毒基因序列的基礎上,通過反向遺傳學手段在酵母菌中快速構建出了活的新冠病毒。該技術能高效合成新冠病毒,尤其在新暴發病毒尚未被成功分離出之前,可以幫助科學家盡快向衛生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株,且該替代方案更為高效、安全。

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以上成果披露自預印本網站BioRxiv於當地時間2月21日發表了一篇名為“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”的論文。該尚未經同行審議。研究團隊首次在試驗中,利用合成基因組學平台快速重建了新冠病毒。

值得注意的是,這是一項根據已知病毒基因組進行病毒重建的基礎研究工作,該成果與此前的謠言之一“新冠病毒是人工合成的” 無關,本研究中實驗室中構建的新冠病毒是在疫情暴發後,根據已經公佈的病毒基因組序列進行的病毒重建研究。

該項研究的作者大多來自瑞士伯爾尼大學的科學家,他們聯合德國、俄羅斯多所科研院校與相關衛生機構共同完成了上述成果。

研究團隊認為,利用已知的病毒基因組序列,通過反向遺傳學手段快速構建出了新冠病毒,可以成為向衛生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株的替代方法,還可以對單個基因進行遺傳修飾和功能表徵,從而爭取時間對疫情暴發做出快速反應。

論文中提到,反向遺傳學被認為是一種不可或缺的工具,它徹底改變了我們對病毒發病機制和疫苗開發的認識。大型的RNA病毒基因組,如冠狀病毒基因組,由於基因組較大且不穩定,很難在大腸桿菌宿主中克隆和操作。研究團隊此次報導了一個基於酵母的合成基因組學平台,用於多種RNA病毒的基因重建,包括冠狀病毒科、黃病毒科和副粘病毒科的成員。

研究人員可利用病毒分離物、克隆病毒DNA、臨床樣本或合成DNA生成病毒亞基因組片段,然後使用轉化偶聯重組技術(TAR)克隆技術將基因組維持為酵母人工染色體(YAC),從而在釀酒酵母中實現一步重組。 T7-RNA聚合酶被用於產生病毒RNA,進而可以產生活病毒。

研究團隊首先在其他RNA病毒(如鼠肝炎病毒MHV)中檢驗了這一平台的準確度,團隊測試了鼠肝炎病毒A59株中含有綠色熒光蛋白(MHV GFP)的基因克隆能力,結果表明測試的克隆中正確組裝了MHV基因組的YAC佔90%,這表明病毒在酵母中的組裝效率很高。

也正是利用該平台,研究人員在拿到合成DNA片段後一周內,對新冠病毒進行了工程改造和復活。

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病毒cDNA克隆及重組SARS-CoV-2和SARS-CoV-2-gfp的重建

具體來看,研究團隊將病毒基因組分成12個片段,大小在0.5kbp-3.4Kbp。同時,為了便於血清學診斷和在細胞培養時追踪,研究團隊將合成新冠病毒設計成可以表達GFP(綠色熒光蛋白)。因此,研究團隊又將片段11分成3個包含GFP序列的子片段,GFP序列被插入ORF7a(開放閱讀框,ORF)中從而在總計有14個片段。

研究團隊讓試劑公司化學合成上述14個DNA片段,1月14日下訂單,2月4日拿到其中的12個片段。片段5和7在大腸桿菌中的克隆出現一些問題未能完成。不過,研究團隊恰好同時獲得了慕尼黑一位患者的新冠病毒樣本(SARS-CoV-2/München1.1/2020/929),他們決定利用RT-PCR擴增獲得片段5和片段7。

利用TAR克隆,對於所有6種新冠病毒構建體,研究人員都獲得了正確組裝的分子克隆。隨後,利用轉化偶聯重組技術 (TAR),用酵母菌的同源重組系統依據末端重複的序列,將這些DNA序列拼到一起。獲得完整的病毒序列後,用T7 RNA聚合酶將這一DNA序列轉錄為病毒RNA,將該RNA用電穿孔技術導入到VeroE6(猴腎細胞)中,使得細胞被感染,培養這些細胞的上清液(含釋放出的病毒顆粒)注入到別的培養基中,可以感染別的細胞。

研究團隊進而表示,“我們能在獲取病毒的合成DNA片段後僅一周的時間內,對最近流行的新冠病毒的化學合成克隆進行工程改造和復活。”病毒的重組有很高的效率和準確度,通常情況下,超過90%的克隆是正確的。

值得注意的是,作者們指出,儘管此前在酵母中進行同源重組已被用於很多分子病毒的克隆,但這一研究在對通過這種方法快速生成大型RNA病毒的全長cDNA的可行性進行了全面評估,尤其是這種大型RNA病毒在大腸桿菌中無法被穩定克隆。

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利用合成基因組學平台克隆RNA病毒基因組

值得注意的是,除新冠病毒外,研究團隊還報導了利用該技術合成構建MHV(鼠肝炎病毒,一種冠狀病毒)和MERS-Cov等,HCov-229E和Zika病毒的構建仍在實驗進行中。