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新冠D614G突变席卷全球:感染力超2.6倍,与毒性无关



新冠病毒(SARS-CoV-2)作为RNA病毒,相比DNA病毒更不稳定,容易变异。关于病毒进化的问题也随之而来:SARS-CoV-2进化到更适应人类了吗?是否更具传染性?是否毒性更大?然而,病毒突变受自然选择、随机的遗传漂移或最近的流行病学特征等多因素影响,这就造成科学家一时难以区分病毒突变是由于适应性还是偶然导致,更难以确定单个突变是否会改变感染或大流行的结果。

截至目前,围绕新冠病毒D614G突变的研究和争议最多。白宫卫生顾问安东尼·福奇美国当地时间7月2日也表示,新冠病毒已经发生变异,可能会让病原体变得更容易传播。就在同日,闻名全球的美国洛斯阿拉莫斯国家实验室(Los Alamos National Laboratory)、杜克人类疫苗研究所和外科系、英国谢菲尔德大学等团队的研究人员在顶级学术期刊《细胞》(Cell)在线发表了一项研究,题为“Tracking changes in SARS-CoV-2 Spike: evidence that D614G increases infectivity of the COVID-19 virus ”。他们的研究结果认为:携带S蛋白D614G的SARS-CoV-2突变株已成为全球大流行中最普遍的形式。

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研究团队对变异频率的动态跟踪显示,G614在国家、地区和城市等多个地理级别上呈现反复增长模式。即使此前已经确定了D614型为主导地位的地区,D614向G614的转变也会发生。他们认为,这一模式的一致性具有高度的统计意义,表明G614变异可能具有适应性优势。

研究团队还发现,相比突变前,更高的病毒载量提示D614G突变病毒和患者上呼吸道病毒核酸水平较高相关。但论文同时指出,“我们发现D614G和疾病严重程度之间没有显著关联。”研究团队还提出,G614突变假病毒与较高的传染性有关,量化分析得出,携带G614突变的病毒颗粒比对应的D614具有明显更高的感染性滴度,增加2.6至9.3倍,并在多种细胞类型中证实。

来自洛斯阿拉莫斯国家实验室等研究团队继续在区域和全球层面监测S蛋白其他的突变,并在公共网站(cov.lanl.gov)定期更新。

该研究的通讯作者、第一作者为洛斯阿拉莫斯国家实验室的计算生物学家Bette Korber,主要研究艾滋病病毒的分子生物学和种群遗传学,为获得有效的艾滋病毒疫苗作出了重大贡献,其中一种目前正在非洲进行人体试验。2004年,Korber曾获得欧内斯特·奥兰多·劳伦斯奖(Ernest Orlando Lawrence Award),该奖是美国能源部颁发的对科学成果最高认可的奖项。

值得一提的是,此前的4月40日,研究团队已率先在预印本平台bioRxiv发表了他们的研究,题为“Spike mutation pipeline reveals the emergence of a more transmissible form of SARS-CoV-2”。随后的5月5日,他们更新发布了第二版。

而自他们的研究公开发表以来,就引发了领域内科学家的广泛讨论。在预印本发表之际,即有质疑者提出,现在就判断任何一种毒株更具传染性都为时过早。一些人甚至提出,G614突变病毒株之所以传播得如此之深远和广泛,是因为它恰好感染了在大流行最初阶段没有采取措施的地区。或许研究者还需要做更多的工作来确定是否有任何毒株比其他毒株更具传染性,以及确定病毒的变异速度是否可能超过疫苗的研发速度。

“这里有很多猜测,他们没有经过实验验证。”休斯顿得克萨斯儿童医院疫苗开发中心的Peter Hotez博士表示。

哈佛大学陈曾熙公共卫生学院的Bill Hanage博士则认为,单点突变不太可能产生任何影响。Hanage写道,重要的是要记住,任何药物或疫苗都要经过测试,以对抗正在传播的任何一种病毒。“病毒能这么早地在所有这些疫苗上找到逃逸突变,那就太幸运了。”他还认为,由于几乎没有人对该病毒有任何自然免疫,因此几乎没有或根本没有导致逃逸突变的选择压力。

值得注意的是,刊发于《Cell》上的这篇论文经同行评议正式刊发的版本和此前的预印本版本发生了很大的变动,减少了猜测性观点,增加了大量实验数据。来自耶鲁大学公共卫生学院、哈佛大学公共卫生学院、哥伦比亚梅尔曼公共卫生学院的三位学者同期在《细胞》杂志则发表了另一篇文章,对洛斯阿拉莫斯国家实验室Korber等人的这项研究作出点评,题为“Making sense of mutation: what D614G means for the COVID-19 pandemic remains unclear”。

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这三位学者提到,Korber等人的新研究是这场争论的核心。“他们提供了令人信服的数据,表明大流行早期出现病毒S蛋白D614G出现了氨基酸变化,而携带G614的病毒现在在世界各地占据主导地位。”但他们提出,关键的问题是:这是否是自然选择的结果,以及这对COVID-19大流行意味着什么?

他们认为,Korber等人提供的这些数据并不能证明G614比D614病毒更具传染性或更易传播。“D614G对COVID-19大流行的潜在影响(如果有的话)仍存在许多问题。”

“早期预警”:追踪新冠病毒S蛋白进化

论文提到,此前已有研究提出,冠状病毒有遗传校对机制,而SARS-CoV-2序列多样性非常低,然而,自然选择仍然可以对罕见但有利于病毒的突变起到作用。

类似的情况是,抗原漂移(antigenic drift)导致流感病毒在流感季节逐渐累积突变,免疫抗性突变和适应性之间复杂的相互作用使抗体抗性在人群中发展,这也就推动了每隔几个季节就需要开发新流感疫苗的需求。更长的流感季节则增加了选择压力的机会。

所谓的抗原漂移,指的是病毒通过改变自己的基因,让蛋白的序列和结构改变,从而使得原本有免疫力的人识别不了。论文指出,虽然SARS-CoV-2显示出一些季节性减弱的迹象,但大流行的持续存在可能使即使研制出疫苗,病毒也会积累与免疫相关的突变。

目前已知的是,普通的感冒冠状病毒OC43、229E,甚至SARS-CoV-1Z中,都存在抗原漂移。虽然目前尚无证据表明SARS-CoV-2存在抗原漂移,但随着广泛的人际传播,SARS-CoV-2也可能获得具有适应度优势和免疫抗性的突变。

研究团队认为,“现在就关注这一风险可能能够抓住病毒的重要进化转变,这对于确保疫苗和免疫治疗干预措施在进入临床时的有效性非常重要。”

目前,全球针对SARS-CoV-2的疫苗大多靶向S蛋白,从而获得保护性的中和抗体。S蛋白介导病毒和宿主细胞结合并入侵,它由S1结构域和S2结构域两部分组成,分别介导受体结合和膜融合。

大多数SARS-CoV-2免疫原和检测试剂都是基于武汉参考序列的S蛋白序列,第一代抗体疗法也是基于早期大流行感染开发的,并使用武汉参考序列蛋白进行评价。然而,研究团队提出,病毒在人与人之间传播时的改变可能会改变病毒的表型和基于免疫的干预措施的效力。

因此,研究团队认为有必要提出“早期预警”策略,以评估大流行期间的S蛋白进化。也就是在新冠疫情发生之后,洛斯阿拉莫斯国家实验室艾滋病毒数据库团队转向了新冠研究,他们将“全球共享流感数据倡议组织”(GISAID)数据库中SARS-CoV-2序列数据作为基准,开发了一项生物信息分析软件,追踪在许多地理区域频率增加的SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸变异。

D614到G614的转变首先发生于欧洲,现已成为全球成为主要形式

在这项研究中,研究团队分析了GISAID数据库中28576个(截至5月29日)S蛋白序列。由于S蛋白突变仍然是较少的,研究团队设置了S蛋白突变的低阈值,被视作可进一步追踪的“兴趣位点”。当研究团队发现和武汉参考序列之间存在0.3%的S蛋白序列差异时,他们就监测其在地理区域随时间增加的频率,以及在不同地理区域反复出现的情况。

在这项研究中,他们展示了第一个氨基酸变异的结果,即D614G。S蛋白D614G氨基酸改变是由武汉参考毒株23403位点的G-A核苷酸突变导致,它是研究团队在3月初的第一次S蛋白突变报告中唯一追踪到的符合他们低阈值设置的突变。

当时,G614的形式在全球还很少见,但在欧洲越来越突出,而GISAID也追踪到了携带D614G分支,并将其命名为“G支”。D614G突变几乎总是伴随着其他3个突变:5’UTR的C-T突变(对应于武汉参考序列的241位点)、3037位点的C-T沉默突变、14408位点C-T突变(导致RNA依赖的RNA聚合酶RdRp氨基酸变化)。

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由这4个基因突变组成的单倍型现在是全球的主要形式。在3月1日之前,在全球997个序列中发现了10%;3月1日至3月31日,14951个序列中发现了67%;4月1日至5月18日,12194个序列中发现了78%。

这就意味着,在一个月的时间内,携带D614G S蛋白突变的毒株成为SARS-CoV-2的全球主导形式。论文指出,从D614到G614的转变首先发生欧洲,随后发生在是北美和大洋洲,然后是亚洲。

研究指出,最早的携带D614G GISAID G分支4突变单倍型部分特征的序列是于1月下旬在中国和德国发现的,它们携带了定义该分支的4个突变中的3个,仅缺少RdRp P323L替换。研究团队分析,这可能是G支的祖先形式。其中一个早期武汉序列和一个泰国早期序列出现了D614G突变,而没有发生其他3个突变;这些可能是独立产生的。

研究团队最早检测到的携带所有4个突变的序列于2月20日在意大利采集。几天之内,这个单倍型在欧洲许多国家取样获得。

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研究团队还从结构层面进行了研究。D614位于S蛋白原聚体的表面,可以与邻近的原聚体接触。研究援引此前的低温冷冻电镜结构指出,相邻的原聚体D614和T859的侧链形成了一个与原聚体之间的氢键,将一个原聚体的S1结构域的残基和另一个原聚体的S2结构域的残基结合在一起。

而突变为G614将消除这个侧链氢键,可能增加主链的灵活性和改变原聚体之间的相互作用。此外,这种替换可以调节附近N616位点的糖基化,影响邻近原聚体近端空间融合肽的动态,或者还将产生其他影响。

D614G和疾病严重程度之间没有显著关联

研究团队还研究了英格兰谢菲尔德地区999名COVID-19患者的临床数据,以此分析突变对疾病严重程度的影响。

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他们发现,相比突变前,更高的病毒载量提示,D614G突变病毒和患者上呼吸道病毒核酸水平较高相关。但论文同时指出,“我们发现D614G和疾病严重程度之间没有显著关联。”D614G与住院关联比较无统计学意义(p=0.66),尽管与ICU有临界意义(p=0.047)。回归分析也进一步证实了G614与更高的住院水平无关。

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不过,研究团队提出,G614突变假病毒与较高的传染性有关。研究量化分析得出,携带G614突变的病毒比对应的D614具有明显更高的感染性滴度,增加2.6至9.3倍,并在多种细胞类型中证实。

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研究团队还测试了如果发生D614G变异,是否同样会被多克隆抗体中和。研究利用了6名圣地亚哥居民(可能在3月初至3月中旬感染,当时D614和G614都在传播)的康复期血清,与携带D614假病毒相比,他们的血清对带有G614假病毒的中和作用相当或更好。

论文指出,“虽然我们不知道这些人感染的是哪种病毒,但这些初步数据表明,尽管在细胞培养中适应性增强,但携带G614的病毒在本质上并不会更能抵抗恢复期血清的中和作用。”

研究团队指出,G614变异的高传染性可能是其迅速传播和持续的充分原因,但也应考虑其他因素。